これがあればもうカンペキ!化学発光ウェスタンブロッティング完全ガイド

これがあればもうカンペキ!化学発光ウェスタンブロッティング完全ガイド

ウェスタンブロッティングは特定のタンパク質を同定するために広く用いられる手法であり、電気泳動で分離されたサンプルをメンブレンに転写して抗原特異的に検出する手法です。今回は、化学発光ウェスタンブロッティングの基本原理と各要因に関してご紹介していきます。弊社製品を最適な状態で使用していただくための実験で役立つヒントやノウハウ、一般プロトコルなどを含むテクニカル・ガイドになりますが、メンブレンを用いる一般的な増強化学発光アッセイにも適用できます。

はじめに

ウェスタンブロッティングは特定のタンパク質を同定するために広く用いられる手法であり、ニトロセルースやPVDFメンブレンに固定化されたタンパク質試料を間接的に検出します。定法ではタンパク質試料はまずSDS-PAGEにより分離された後、電気的にメンブレンに転写されます。ブロッキングステップに続いて、メンブレンは抗原に対する一次抗体(ポリクローナルまたはモノクローナル)によってプローブされます。洗浄ステップにより未反応の一次抗体を取り除いた後、メンブレンは一次抗体を認識する酵素標識二次抗体と反応させます。標識酵素としてはアルカリフォスファターゼ(AP)または西洋わさびパーオキシダーゼ(HRP)が最も一般的です。さらにメンブレンを洗浄してから酵素に応じた基質と反応させます。このようにウェスタンブロッティングでは酵素の活性を利用したシグナルを得ることで抗原を間接的に検出します。

今回は、化学発光ウェスタンブロッティングの一般原理と各要因に関してご紹介していきます。弊社製品を引用していますが、メンブレンを用いる一般的な増強化学発光アッセイにも適用できます。

化学発光ウェスタンブロッティングのタイプと影響する要因

最も一般的なウェスタンブロッティング基質はルミノールベースの化学発光基質です。化学発光はエネルギーを光として放出する化学反応です。西洋わさびパーオキシダーゼ(HRP)と過酸化水素の存在下ではルミノールは酸化され励起状態の反応生成物を形成します。この反応生成物が励起状態から基底状態に戻る際のエネルギーが光として放出されます。この放出光は酵素基質反応の間だけ生じるため、酵素の近傍に存在する基質が消費されれば放出光は途絶えることになります。対称的にDABなどの発色基質では酵素基質反応が停止した後もメンブレン上に残る沈降物を生じます。

シグナルの検出

ウェスタンブロッティングが一般的なアプリケーションになって久しいですが、S/N比の高い最適なバンドを得るのは簡単ではありません。ウェスタンブロッティングは手技を要する一連の連結したステップから構成されるため、最終的なシグナル獲得には途中のさまざまな要素が関連するからです。多くの変動的な要素が関与するウェスタンブロッティングでの問題を解決することは、干し草の山から針を探し出すことにも似ています(表1)。既存のプロトコルに沿っていても特定のサンプルの検出が難しいことはよくあります。

たとえば、nativeな高次構造を保持したタンパク質を認識する一次抗体を用いた場合に、メンブレン上に固定されて変性した抗原を認識しない場合がありますが、電気泳動を非変性条件下で行った場合、メンブレンに転写後の抗原タンパク質はネイティブな構造を保持している可能性があり検出できる可能性があります。ただし、バンドとして検出できたとしても、目的タンパク質の分子量の特定は困難になります。

さらに非常に高分子量のタンパク質や疎水的なタンパク質ではメンブレンへの効率的な転写が難しいことがあります。そのためより確実に目的タンパク質を検出できるように1979年にはじめて紹介されたTowbinのプロトコルはこれまで何度も改変されてきました。あえてメンブレンへの転写を避けてゲル内で検出することもあります。

表1 ウェスタンブロッティングに影響する要因
要因 変動特性
抗原(目的タンパク質) 立体構造、安定性、エピトープ
ポリアクリルアミドゲル ゲル製造元、アクリルアミド濃度、保存期間、製造ロット
メンブレン メンブレン製造元、タイプ、製造ロット
一次抗体 特異性、力価、親和性、反応時間および反応温度
HRP標識二次抗体 酵素標識レベルと酵素活性、ホスト動物種、濃度
ブロッキングバッファー タイプ、濃度、交叉反応性
洗浄 バッファー、使用量、洗浄時間、洗浄回数
基質 感度、製造ロット、保存期間
検出法 保存期間、製造元

シグナル強度とシグナル継続時間

ウェスタンブロッティングの各条件が使用する基質に至適化されていれば、化学発光シグナルは少なくとも6-24時間(弊社製品のSuperSignalシリーズの場合)継続します。シグナル強度と継続時間は検出に用いられる特定の化学発光基質と検出系に存在する酵素-基質比に依存します。

ブロット上の化学発光基質は相対的に一定ですが、存在する酵素量はメンブレン上の抗原量と添加された一次抗体量と酵素標識二次抗体に依存します(表1)。酵素標識物が検出系に過剰に存在するとバックグラウンドの上昇・シグナル継続時間の短縮・感度の低下につながります。これは最も頻度の高い不具合の原因です。ゆっくりと強度減衰するエミッションカーブ(図1)は理想的であり、これは検出系が至適化され信頼できる結果が得られていることを意味します。急速に減衰するシグナルは結果の変動性や感度の低下の原因となり、シグナルの画像化さえできない場合もあります。

長く安定的に継続するシグナルは転写効率や基質の製造ロット間での変動を最少に抑えることもできます。HRPが基質に特有な発光継続時間内その活性を維持できるとしても、ルミノールがHRPを回転させ失活させることが指摘されています。酸化反応の際に生じるフリーラジカル生成物はHRPに結合することがあり、そうなるとHRPはもはや基質と相互作用することができなくなります。検出系に過剰に存在するHRPは過剰なフリーラジカルを生み出し、HRP失活の可能性を高めます。さらにフリーラジカルは抗原にもダメージを与えるため再プローブの際の検出にも影響がでることがあります。

chemiluminescent-westernblotting-fig1

図1 化学発光法において過剰量の酵素を使用した場合に見られる現象。過剰の酵素標識抗体を用いると下記のような現象がみられる場合があります。このような時は抗体濃度(希釈率)の至適化を行います。

直接法と間接法

直接法では標識一次抗体を用います。二次抗体との反応が省かれるため、間接法と比べて短時間で終了します。さらに二次抗体の交叉反応に由来するバックグラウンドノイズの心配もありません。同時に複数の抗原をプローブすることも可能です。ただし一次抗体への標識は抗原認識に不都合な影響を与えることがあり、さらにすべての条件が至適化されていたとしても間接法で得られるようなシグナルの増幅は起こりません。必然的に直接法で得られる検出感度は間接法に比べて低く、抗原が比較的豊富に存在する場合にのみ行われます。直接法の選択肢としては一次抗体のビオチン化があり、間接法でありながら二次抗体を使用せずにシグナルの増幅が可能になります。ビオチン化試薬による標識では一般的に抗体1分子あたり複数のビオチンを修飾するようなプロトコルで行われます。ビオチン1分子に対してHRPが標識されたアビジンやストレプトアビジンまたはNeutrAvidinが結合することでシグナルの増幅をおこなうことができます。この場合、HRP標識アビジンは二次抗体の代わりに使用され、また使用時のモル濃度は基本的には二次抗体の場合と同じです。

ファーウェスタン法

抗原特異抗体の使用が適切でない場合や利用できる抗体が存在しない場合があります。目的タンパク質と作用するタンパク質(結合パートナー)をプローブに利用できれば、ウェスタンブロッティングは可能です。この手法はファーウェスタンブロットと呼ばれタンパク質-タンパク質間の相互作用(PPI; Protein:Protein Interaction)検出に用いられます。相互作用検出には無数の手法があり、さまざまなストラテジーが報告されています。抗体を用いる手法と同様に、標識された結合パートナーが用いられ、標識には35Sによるin-vitroでの反応も利用されます。またはプローブのビオチン化と標識されたアビジンまたはアビジン様タンパク質が使用され、シグナルの増幅が図られることもあります。ただし結合パートナーへの過剰標識によって相互作用を阻害しないように細心の注意をはらう必要があります。GST, HA, c-Myc, FLAGなどのタグと共発現させた組換え型プローブとタグ抗体を用いることもあります。ウェスタン同様にファーウェスタンでもメンブレン上またはゲル内で検出されます。

化学発光ウエスタンブロッティングの最適化

各ウェスタンブロットで一貫した良好な結果を得るには実験系を至適化しなければいけません。シグナル強度やシグナル継続時間にはさまざまな要因が影響するため、各要因をそれぞれ至適化する必要があります。以下では各要因の至適化について触れ、プロトコル・セクションでは至適化操作に関する簡単なインストラクションを示します。

メンブレン

HRP-ルミノールの反応と発生するシグナルは一般的にはメンブレンの組成には影響されません。ただしニトロセルロース(NC)メンブレンやPVDFメンブレンはタンパク結合特性が異なり、一般的にPVDFはタンパク質の結合キャパシティも高く、取扱いも容易ですが、水和にはメタノール処理が必要です。NCメンブレンは簡単に水和でき、ドットブロットに便利です。各ウェスタンブロッティング系でメンブレンタイプ、製造元、製造ロットに関して経験的に最適な製品を決定することが重要です。一度、その系で最適なメンブレンを決定したら、できるかぎり同一ロットのメンブレンを使い続けることも大切です。

目的タンパク質

転写効率はタンパク質間で劇的に異なることがあります。タンパク質はゲルからの移動度やメンブレンへの結合特性で大きく異なります。転写効率はゲルの組成、ゲルとメンブレンとの接触、電極の位置、転写時間、タンパク質の分子量や組成、電場の強度、さらに界面活性剤の有無などの要因に依存します。ほとんどのタンパク質では低イオン強度下と低電流下の転写で最適な結果が得られます。転写効率は可逆的なメンブレン染色により確認できます。

ブロッキングバッファー

ウェスタンブロッティングではさまざまなブロッキングバッファーが利用されます。すべての検出系で最適なブロッキングバッファーは存在せず、至適化には予備実験が必要になります。至適化されたブロッキングバッファーはシグナルノイズ比を最大にして、検出系で用いられる抗体や抗原との結合を最少に抑えます。たとえば、ブロッキングバッファーとして汎用される5% ノンファットミルクをアビジン/ビオチン系で使用した場合、ミルクに含まれる内在性のビオチンがアビジンと結合してバックグラウンドノイズが著しく上昇することがあります。基質、抗体、または抗原を変更した場合、単に新しい系にブロッキングバッファーが至適でないという理由だけで、特異的なシグナルの低下やバックグラウンドノイズの上昇が生じることがあります。

また、Tween®-20などの界面活性剤をブロッキングバッファーに添加することで結果が改善される検出系もあります。界面活性剤はブロッキングバッファーが抗体と非特異的に結合することを阻止してバックグラウンドを最小に抑えます。ただし、過剰な界面活性剤の添加はメンブレンのブロッキングを妨げることがあります。最終濃度0.05%での界面活性剤が一般的に用いられますが、特定の系で界面活性剤の使用が適しているか、何%が最適な濃度かを確かめる必要があります。いずれにせよ不純物を含まない高純度な界面活性剤を使用することが再現性の高い結果を得るためにも重要です。

抗体

一次抗体の抗原に対する親和性だけが重要ではなく、一次抗体濃度と二次抗体濃度もシグナルエミッションには大きく影響します。メンブレン上に固定されるHRPは一次抗体濃度や二次抗体濃度に依存します。一次抗体を最少量に抑えることには抗原特異的な結合を促進してバックグラウンドを低く抑制するという利点があります。ウェスタンブロッティングで適当なシグナルを得ることに失敗した場合、検出に使用された全ての試薬を除去してから一次抗体を変更するか抗体濃度を変更して再プローブすることにより貴重なサンプルと再泳動に必要な時間を節約することができます。ただし、抗体剥離が不十分だと一次抗体やHRP標識二次抗体をメンブレン上に残すことになり、HRP活性が維持されている場合には剥離後のメンブレンに基質を添加することで発光シグナルが検出されてしまいます。

また、メンブレン上に残存するHRPが不活性であっても続いて添加される一次抗体の抗原認識が阻害されることになります。抗体剥離と再プローブは系に特異的な情報を得る効果的な手法ですが、最適な系のパラメーターを決定するための方法ではありません。

検出法

化学発光ウェスタンブロッティングのシグナル検出にはフィルムが従来から用いられてきました。フィルムは高価な機器を必要とせず感度の高い検出を可能にします。残念ながらフィルムは一回しか使用できず、シグナルを確認するためには現像が必要です。実際に現像するまで行われた露光時間が適切かどうかを知ることはできないため、トライ&エラー(通常、数枚のフィルム)が必要になります。

フィルムのダイナミックレンジは広く、露光過剰なフィルムでもシグナルノイズ比は維持されています。このため、露光過剰なフィルムもPierce Background Eliminator Kit(図2)などの試薬を用いることでフィルム全体のシグナルを等しく低減することができます。

冷却CCDカメラも現在ではシグナル検出に一般的に使用されます。これらのイメージャーと関連ソフトウェアによる解析はバックグラウンドノイズの調整やデンシトメトリー解析(写真濃度解析)も可能で、フィルムベースの検出に比べて利点があります。広いダイナミックレンジと高度な露光制御により、データを不明瞭にするバックグラウンドノイズを補正したイメージを得ることができます。さらに露光時間の至適化によりシグナルの飽和を防ぎわずかな濃度差の確認を可能にします。CCDイメージャーに比べるとフィルムはダイナミックレンジが狭く、すぐにシグナルが飽和に達するため、しばしば露光過剰となります。

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図2 Pierce Background Eliminatorによるバックグラウンド軽減。組換え型ヒトTNFαを4-20% SDS-PAGEにより分離してニトロセルロースメンブレンに転写しました。メンブレンのブロック後、Mouse anti-human TNFα および Goat antimouse-HRPによりプローブ、化学発光基質SuperSignal West Dura Substrateにより検出しました。露光時間30秒間でフィルムを用いて発光シグナルを画像化(A)し、つづいてフィルムをPierce Background Eliminatorで2分間処理(B)しました。フィルム上のシグナル強度を全体的に下げることで、露光過剰なバンドとバックグランド上のシミが軽減されていることがわかります。

化学発光ウエスタンブロッティングにおけるよくある現象とその原因

シグナルが検出されない

一回目の露光でシグナルが検出できない場合、実験系が至適化されていない可能性があります。シグナルの欠如はメンブレン上に存在する過剰なHRPが原因となることがよくあります。直観的に考えると、シグナルが検出できない際にHRP量を減らすのは逆効果に感じるかもしれません。しかし、シグナルの検出を成功させるには酵素と基質が正しいバランスで存在することが重要です。酵素による基質の酸化は不可逆な反応であり、一度酸化された基質は酵素と結合することはできません。酵素活性は長時間継続するため、化学発光では基質が最大の制限因子となり、基質が完全に消費されれば発光シグナルも停止します。もちろん、酵素量が不足していることでシグナルが検出できない場合も稀にありますが、ほとんどの場合は過剰な酵素が系に存在することが原因となっています

検出可能なシグナルを得るにはウェスタンブロッティングのパラメーターを調節します。再現性のある結果を得るためには、新しいゲルを用意してサンプル量を減らしてアプライするか抗体の至適濃度を確認します

抗体濃度が至適化されているかを確認するにはメンブレンの基質との反応と露光を2回行います。1回目の露光は基質と反応させた直後に行い、2回目の露光は基質との反応から1-2時間間隔をおいて行います。2回目の露光からは抗体濃度の至適化に必要な情報を得られるはずです(注;至適化に関する操作を参照)。

また、1回目の露光でシグナルが検出されなかった場合でも、メンブレンをリンスして改めて新しい基質との反応を行うことでシグナルが検出されることがあります。これは1回目の反応でHRPの大部分が失活した場合でも活性を維持したHRPが残存していれば、新しく添加された基質との2回目の反応でシグナルが放出されているからです。メンブレンから検出試薬を除去して再プロービングすることで、サンプルを無駄に消費せずにパラメーターを至適化することもできます。ブロット間での一貫した結果を得るには、各実験において同一条件で同一操作を行うことが重要です。

シグナルが急速に減衰する

もしシグナルが急激に減衰したら、そのウエウスタンブロッティングの検出系は至適化が必要です。ただし一時的にでもシグナルが検出されているのであれば、系はかなり至適条件に近いと考えられます。転写効率やサンプルのわずかな差異、保存中や操作中に生じた抗体活性のわずかな変化が原因です

新しいロットでシグナルが検出されない

基質のボトル変更や製造ロット変更だけでシグナルが検出されなくなることもあります。これもウェスタンブロッティングが完全に至適化されていない場合に生じる現象です。基質も基本的には変動します。多くの基質製造メーカーでは基質の品質を厳密にコントロールして製造していますが、新しく開封したばかりのボトルでは、古くなった基質よりも感度が高くなることがあります。完全に至適化された検出系では、このようなボトル間や製造ロット間でのわずかな差には有意の影響は受けません。

また、極めて高感度の検出ができるロットで至適化した実験系でも、ロットを変えた場合にまったく検出されなくなる場合があります。これは多くのメーカーが品質保証している製品の感度は最低検出感度のみであり、最高感度については保証をしておらず、きわめて発現量の少ないタンパク質をぎりぎり検出できたとしても、別のロットでは検出できなくなることがあります。

メンブレン上に茶色または黄色のバンドがみえる

HRPは酸化して不活性になると茶色に変色します。HRP酵素標識二次抗体には低い割合ですが酸化型の酵素が含まれます。酸化型HRPの存在率は非常に低く、至適化された系ではHRPの色はメンブレン上で見えることはありません。メンブレン上のバンドが黄色~茶色に見えるのは大量のHRPが固定されて、酸化された不活性なHRPが存在する証拠です

さらに基質の存在下では過剰なHRPが局在する箇所にフリーラジカルが過剰に発生します。このフリーラジカルはHRPを不活性にして抗体、抗原、メンブレンにダメージを与えてしまい効果的な再プローブを難しくします。

バンドやメンブレン全体が暗室で発光している

基質と反応させたメンブレンから暗室内で(バンドパターンやメンブレン全体の)発光が肉眼で確認されたら、過剰なHRPが存在する証拠です。この現象は少なくとも二次抗体の希釈が必要で、もしかしたら一次抗体の希釈も同様に必要であることを意味しています。HRP過剰には多くの要因が関与していますが、ブロット全体の発光が確認されたのであればブロッキングと洗浄の至適化も必要かもしれません。

ゴーストバンドや白ぬけバンド

中心部だけ白く抜けたバンドやゴーストバンド(高いバックグラウンドの中でバンド全体が白く抜けたバンド)は白く抜けた部分で基質が局所的に消費されたことを意味します。ゲルに添加された抗原量が過剰であり、使用されたHRP標識二次抗体濃度が高いことが最も典型的な原因とされます

高いバックグラウンド

不十分なブロッキング、抗体のブロッキングバッファーとの交叉反応、過剰に使用された酵素標識物のどれもがバックグラウンド上昇の原因となります。特定の基質自体がバックグラウンドの原因となりうると考える研究者や、基質自体がバックグラウンドを上昇させると考えている研究者もいますが、酵素の触媒作用がなければ基質がシグナルを発生させることはありません。以前に使用していた基質より感度がはるかに高い基質を使用する場合、高感度な基質を補うだけに十分なパラメーターの変更が行われていないとバックグラウンドが上昇します。最適な濃度の抗体を用いることで抗原特異的な結合が促進されバックグラウンドノイズは抑制されます。

化学発光ウェスタンブロッティングと抗体剥離に関する一般プロトコル

このセクションではウェスタンブロッティング、メンブレンからの抗体剥離、至適化、トラブルシューティングについて一般的なプロトコルを紹介します。このプロトコルは一般的なウェスタンブロッティングのプロトコルであり、さまざまな条件について網羅的に記述していませんが、ウェスタンブロッティングの実際の操作概要は理解できます。

弊社製品にはプレキャストゲル、電気泳動バッファー、洗浄バッファー、ブロッキングバッファー、一次抗体、二次抗体、化学発光基質、フィルムなどウェスタンブロッティングに必要な試薬が揃っています。

ウェスタンブロッティング・プロトコル

  1. サンプル中のタンパク質をゲル電気泳動で分離します。
  2. 転写バッファーの調製: 400mlのトリスグリシン転写バッファーに100mlメタノールを添加します。(25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.0, 20% methanol). 転写バッファーは4℃で使用・保存します。
  3. タンク式は図3のようにゲルをサンドイッチ状にセットします。セミドライ式も同様に正極と負極の間にゲルをセットします。
  4. ゲルからメンブレンにタンパク質を転写します。ミニゲル用のタンク式転写装置ではバッファーの温度を4℃に維持しながら40Vで90分間、セミドライ式では15Vで90分間など、転写装置の推奨条件に従います。
  5. 転写後のメンブレンを取り出し、室温で攪拌しながら20-60分間ブロッキングバッファー中でメンブレンの非特異的結合サイトをブロックします。
  6. 最終濃度10%でブロッキングバッファーを添加した一次抗体溶液中(表2)とメンブレンを攪拌しながら室温で1時間インキュベートします。2-8℃でオーバーナイトのインキュベーションも可能です。
  7. 0.05% Tween-20を含むTBSやPBSなどの生理的条件の洗浄バッファーでメンブレンを3回(各5分間)洗浄します。酵素標識一次抗体を使用する場合、ステップ10に進みます。
  8. 最終濃度10%でブロッキングバッファーを添加した酵素標識二次抗体(表2)とメンブレンを攪拌しながら室温で1時間インキュベーションします。
  9. メンブレンを洗浄バッファーで5回(各5分間)洗浄して未反応な酵素標識二次抗体を除去します。ここでメンブレンを十分に洗浄することが重要です。
  10. 基質を調製します。メンブレンが完全に浸る程度の十分量(0.125 ml/cm2)を用いてメンブレンを処理します。
  11. Pierce Western Blotting Substrateの場合は1分間、SuperSignalの場合は5分間、基質と反応させます。
  12. メンブレンを基質から取り出し、プラスチック製プロテクターにセットします。メンブレン・プロテクターがおすすめですが、プラスチック製ラップでも代用できます。メンブレンとプロテクターの間の気泡を除去します。
  13. フィルムまたはCCDカメラで発光シグナルを画像化します。
chemiluminescent-westernblotting-fig3

図3 転写装置

表2 Pierce 化学発光基質での一次抗体濃度と酵素標識二次抗体濃度
基質 Pierce Western Blotting Substrate SuperSignal West Pico SuperSignal West Dura SuperSignal West Femto
一次抗体濃度 0.2 – 10 μg/ml 0.2 – 1 μg/ml 0.02 – 1 μg/ml 0.01 – 0.2 μg/ml
二次抗体濃度 67 – 1,000 ng/ml 10 – 50 ng/ml 4 – 20 ng/ml 2 – 10 ng/ml

抗体剥離プロトコル

  1. 抗体剥離バッファーを調製します。下記の4つの抗体剥離バッファーからひとつを選択します。
  2. 抗体を剥離するメンブレンを抗体剥離バッファーに浸します。メンブレンが浸る程度の十分量(8×10 cmメンブレンでは約20ml)を使用します。
  3. 室温で5-15分間反応させます。最適な結果を得るには反応時間および反応温度の至適化が必要です。抗体の親和性によっては37℃での15分間以上の反応が必要な場合もあります。バッファー C)を用いる場合、70℃での30分間の反応が必要です。
  4. メンブレンを剥離バッファーから取り出し、メンブレンを洗浄バッファー(0.05% Tween-20を含むPBS/TBSまたは生理的条件のバッファー)で洗浄します。
  5. 酵素標識二次抗体と一次抗体が完全に除去されたことを確認するには以下の試験を行います。いずれかの試験でシグナルが検出された場合、さらに5-15分間のあいだ温度を37℃まで上昇させ、操作2-4を繰り返します。抗原にダメージを与えず抗体を完全に除去できる反応時間と反応温度に至適化します。
    • 酵素標識二次抗体が完全にメンブレンから除去されているかを確認するには、抗体剥離後のメンブレンを基質と反応させてフィルムなどで画像化します。もし、5分間の露光でフィルムにシグナルが検出されなければ、酵素標識二次抗体は完全にメンブレン上から除去されているはずです。
    • 一時抗体が完全にメンブレンから除去されているかを確認するには、抗体剥離後のメンブレンを酵素標識二次抗体と反応させた後、メンブレンを洗浄バッファーで洗浄します。メンブレンを基質と反応させてフィルムなどで画像化します。もし、5分間の露光でフィルムにシグナルが検出されなければ、一次抗体は完全にメンブレン上から除去されているはずです。
  6. 抗体がメンブレンから適切に剥離される条件を確認したら、再プロービングを開始します。一般にメンブレンの抗体剥離および再プロービングは数回まで可能ですが、再プロービングでは長時間のインキュベーションや高感度な基質が必要になることがあります。

化学発光ウェスタンブロッティングの条件至適化に関する操作

抗原濃度の至適化

  1. SDS-PAGEサンプルバッファーを用いてタンパク質試料を異なる濃度で調製します。広範囲の濃度を試験することが重要ですが、かならず使用する基質の検出下限以上の濃度で調製します。
  2. 各濃度の試料を等量でゲルにアプライ、電気泳動により分離した後、メンブレンに転写します。
  3. メンブレンを標準的なブロッキングバッファーによりブロック、一次抗体でプローブした後、酵素標識二次抗体でプローブします。一次抗体および酵素標識二次抗体の至適化濃度が決定されていない場合には使用する基質に応じた推奨濃度域の中間濃度でプローブします。
  4. メンブレンを洗浄して基質を添加します。適当な方法でシグナルを画像化します。

ブロッキングの至適化

  1. 電気泳動によりタンパク質試料を分離してメンブレンに転写するか、メンブレン上にドットブロットします。
  2. 試験するブロッキングバッファーの条件検討数に応じてメンブレンをストリップ状にカットします。各ブロッキング条件について以下の組み合わせで行います。
    • ブロッカー + 一次抗体 + 酵素標識二次抗体+ 基質
    • ブロッカー + 酵素標識二次抗体 + 基質
    • ブロッカー + 基質
  3. 各ストリップを十分量のブロッキングバッファーを用い攪拌しながら室温で1時間ブロックします。
  4. 最終濃度10%でブロッキングバッファーを添加した一次抗体および/または酵素標識二次抗体を試験するストリップに応じて添加します。一次抗体および酵素標識二次抗体の至適化濃度が決定されていない場合には使用する基質に応じた推奨濃度域の中間濃度でプローブします。
  5. メンブレンを洗浄して基質を添加します。適当な方法でシグナルを画像化します。

一次抗体濃度の至適化

  1. 電気泳動によりタンパク質試料を分離してメンブレンに転写するか、メンブレン上にドットブロットします。
  2. メンブレンを標準的なブロッキングバッファーによりブロックします。試験する一次抗体濃度の検討条件数に応じてメンブレンをストリップ状にカットします。
  3. 最終濃度10%のブロッキングバッファーを含む洗浄バッファーを用いて一次抗体の希釈系列を調製、ストリップに添加します。室温で1時間反応させます。
  4. ストリップを洗浄して酵素標識二次抗体と室温で一時間反応させます。再度ストリップを洗浄して後、基質と反応させてシグナルをフィルムまたはCCDカメラで検出します。

メンブレン洗浄条件の至適化

  1. 0.05% Tween-20を含むPBS, TBS, または生理的条件のバッファーを洗浄バッファーとして用います。
  2. メンブレンを穏やかに攪拌しながら5分間洗浄します。一次抗体との反応の後の洗浄は少なくとも3回以上行い、酵素標識二次抗体との反応の後は少なくとも5回以上洗浄します。
  3. シグナルの検出で非特異的なバックグラウンドが確認された場合、使用する洗浄バッファー量を増やすか、洗浄回数または洗浄時間を増やします。改善が認められない場合、原因は洗浄条件以外にあります。

酵素標識二次抗体(酵素標識物)の至適化

新しいウェスタンブロッティングの系で至適濃度を求める際、簡単な実験で変動的なシグナルに伴う問題を改善できることがあります。

  1. 等量のタンパク質試料を3レーン以上ゲルにアプライします。
  2. タンパク質試料を電気泳動で分離してメンブレンに転写します。非特異的サイトをブロックするためにブロッキングを行った後、一次抗体でプローブします。
  3. 洗浄後、メンブレンをストリップ状にカットします。
  4. 試験する異なる濃度の酵素標識二次抗体でプローブします。たとえば、SuperSignal West Pico Substrateを使用する場合、1:4000, 1:6000, 1:8000の希釈倍率(1 mg/mlストックからの希釈倍率)で試験します。室温で攪拌しながら1時間反応させます。
  5. ストリップを洗浄、基質と反応させた後、発光シグナルをフィルム等に露光します。
  6. 1-2時間待って、再び発光シグナルをフィルム等に露光します。
  7. 結果を評価します。たとえば、2回目の露光において1:8000希釈でシグナルが得られ他の希釈倍率ではシグナルが検出されなかった場合、1:8000希釈が最も至適条件に近いことになります。しかし、1:4000希釈で強いシグナルが得られ他の希釈倍率ではシグナルが得られない場合、より希釈倍率の低い(高濃度な)酵素標識二次抗体濃度が至適条件に近いことになります。

検出法の至適化

  1. 電気泳動によりタンパク質試料を分離してメンブレンに転写するか、メンブレン上にドットブロットします。
  2. メンブレンの非特異的サイトをブロックするためにブロッキングを行った後、最終濃度10%のブロッキングバッファーを含む一次抗体および酵素標識二次抗体でプローブします。
  3. 一次抗体および酵素標識二次抗体の至適化濃度が決定されていない場合には使用する基質に応じた推奨濃度域の中間濃度でプローブします。
  4. 試験する基質の検出条件数に応じてメンブレンをストリップ状にカットします。試験する基質を調製します。
  5. 製造元推奨条件でストリップを基質と反応させます。
  6. ストリップをピンセットで基質から取り出し、ペーパータオルの上でタップ、余剰な基質を除去します。
  7. ストリップをプラスチック製カバーにセットして、さまざまな時間で露光します。バックグランドの低い露光時間を選択します。

次回は検出感度をあげたい場合のポイントについてご紹介します。

参考文献

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