フローサイトメーターを用いた大腸菌の生死判定

フローサイトメーターを用いた大腸菌の生死判定

はじめに

フローサイトメトリーとは、細胞や粒子などを1つ1つ流路へ流し、それぞれの細胞の特徴を解析する手法です。一般的に血液や動物細胞などで広く利用されていますが、フローサイトメーターで解析するためのサンプル条件は非常にシンプルです。

  1. 細胞が凝集せず、単細胞(single cell)の状態で分散していること
  2. 水溶液に溶解・懸濁していること
  3. 大きさが1 ~ 40 μm 程度

今回は、Invitrogen™ LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability and Counting KitInvitrogen™ Attune™ Acoustic Focusing Cytometerを用いて、大腸菌の生死の判定測定を行いました。

サンプルの準備

サンプルに含まれる大腸菌は106cells/mL 以下になるように適切なバッファーで希釈します。
※培養液で希釈するとバックグラウンドが高くなる可能性があります。
※濃度が分からない場合は、段階希釈して測定してください。

希釈済み大腸菌液 997 μL
↓ +SYTO 9 (3.34 mM) 1.5 μL
↓ Propidium iodide (PI:30 mM) 1.5 μL
↓ 室温 , 15min , 遮光でインキュベーション
Attune Acoustic Focusing Cytometer にて測定

結果


Attune Acoustic Focusing Cytometer では、サンプルの濃度(event/μL)を自動で出すことができます。

測定のコツ

  • 検体を希釈するバッファー(生理食塩水)などは予め0.22 μm のフィルターでろ過します。
  • 微生物は、前方散乱光によるサイズ解析ではノイズと区別するのが難しいため、まずバッファーのみでノイズ(バックグラウンド)の位置を確認します。次にBL1 にThreshold(閾値)を設定して、蛍光を発しているポピュレーションのみを解析します。

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