フローサイトメーターを用いた酵母の生死判定

フローサイトメーターを用いた酵母の生死判定

はじめに

酵母は、古くからパンやビールなどの発酵食品に利用されたり、真核生物のモデル生物として広く研究されています。酵母を利用する上で生菌数を確認するのは重要ですが、従来はプレートで長時間培養後にコロニー形成数をカウントしていたため、迅速な解析ができませんでした。また遺伝子工学的手法、例えばリアルタイムPCRなどを用いる方法も、生菌・死菌の両方が検出されるため判別は容易ではありません。そこで今回は、Invitrogen™ LIVE/DEAD ™ FungaLight™ Yeast Viability KitInvitrogen™ Attune™ Acoustic Focusing Cytometerを用いて、サンプル中に含まれる酵母の生死の判定を測定しました。

サンプルの準備

サンプルに含まれる酵母は106cells/mL 以下になるように適切なバッファーで希釈します。
※培養液で希釈するとバックグラウンドが高くなる可能性があります。
※濃度が分からない場合は、段階希釈して測定してください。

希釈済み酵母 998 μL
↓ +SYTO 9 (3.34 mM) 1.0 μL
↓ Propidium iodide (PI:20 mM) 1.0 μL
↓ 室温 , 15min , 遮光でインキュベーション
Attune Acoustic Focusing Cytometer にて測定

結果

データ例:酵母(Saccharomyces cerevisiae )

測定のコツ

  • 検体を希釈するバッファー(生理食塩水など)は予め0.22 μm 径 のフィルターでろ過します。
  • FSC/SSC プロットでノイズと区別が付けにくい場合は、Log スケール表示に切り替えると確認が容易になります。
  • 死細胞のポジティブコントロールは70% イソプロパノールもしくは熱処理したサンプルを使用します。


Attune NxT Acoustic Focusing Cytometerでは、カウンティングビーズを使用しなくてもサンプルの濃度(event/μL)や
絶対数を出すことができます。

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