【リアルタイムPCRユーザー必見】プライマーダイマーを減らすPowerUp™SYBRアッセイとは?

【リアルタイムPCRユーザー必見】プライマーダイマーを減らすPowerUp™SYBRアッセイとは?

リアルタイムPCRの解離曲線でみられる問題点

みなさんは、リアルタイムPCR (qPCR )の解離曲線(融解曲線)において、複数のピークを目にしたことがあるでしょうか? 下図は、従来のSYBRベースのアッセイによって得られた解離曲線データです。

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ご覧のとおり、ターゲットの86.7℃のメインピークのほかに複数のピークが確認できます。

 

しかし、ここで結果として見えてほしいのは、単一DNA由来増幅産物から得られる“ひとつの明確なピーク”です。なぜなら、qPCRの解離曲線において複数のピークが観察されるということは、2つ以上の目的以外のPCR産物が増幅されたことを示唆するからです。

※詳細については、3分で分かる動画も公開していますので、ぜひご覧ください。

では、そもそもなぜ目的以外の増幅が生じてしまったのでしょうか?

考えられる主な要因として、以下の2点が挙げられます。

  1. プライマーの非特異的な結合
  2. プライマーダイマー等の形成

1.「プライマーの非特異的な結合」に対しては、温度条件変更やプライマーの再設計などいくつか対処方法が考えられます。しかしながら、SYBRベースでの手法では時間や手間がかかるため、簡便に有効な結果を得るためのアプローチとしては、TaqMan Assaysが知られています。そこで今回は、2.「プライマーダイマー等の形成」を防ぐのに適している、新型のSYBRベースアッセイ、PowerUp™ SYBR™ Green Master Mixについて紹介します。

 

新しく登場したPowerUp™SYBRアッセイの特徴とは?

下図は従来の他社のSYBRベースアッセイと、新型であるPowerUpSYBRアッセイについて、非特異的な増幅であるプライマーダイマー等の形成に着目し、性能を比較してみた結果です。テンプレートDNAを含まない状態でqPCRを行ったところ、他社SYBRベースアッセイ(他社ミックスT1&T2)では高確率でプライマーダイマー由来と考えられる増幅が生じていることがわかりました。一方で、PowerUp TM SYBRアッセイではほとんど目的以外の産物が検出されませんでした。

このことから、PowerUpTM SYBRアッセイはプライマーダイマー等由来の非特異的増幅を防ぐのに適したアッセイだといえるでしょう。他にも、PowerUp TM SYBRアッセイには特徴的な機能がありますので、詳細についてはこちらをご覧ください。

  • 28種のプライマーセットを使用し、テンプレートDNAの代わりにNuclease Free Waterを添加し測定(n=3)
  • 増幅したウェルの陽性率およびCt値を算出し評価
  • Ct値が低いほど増幅が早く実際の定量値に影響を与えやすい

 

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