よくわかる組織染色の基礎知識|知っておきたい!タンパク質実験あれこれ 第17回

よくわかる組織染色の基礎知識|知っておきたい!タンパク質実験あれこれ 第17回

免疫組織化学は、組織上の目的成分の存在や局在を顕微鏡下で可視化するために、特異抗体を利用して標的抗原を検出する方法です。その原理は1930年代には既に知られていたそうですが、文献としては、Coonsらの1942年の報告が最初とされています。この文献では、肺炎球菌の抗原検出にFITC標識した抗体を用いています。この手法は蛍光抗体法と呼ばれており、蛍光顕微鏡により観察します。

抗原抗体反応を可視化する方法としては、この蛍光抗体法の他に、酵素を標識した抗体と発色基質を利用し、酵素反応により生じる呈色を光学顕微鏡で観察する酵素抗体法や、アイソトープを利用する方法、金コロイドを利用する方法があります。免疫組織化学は、生物学的な研究目的だけでなく、病理診断や薬剤開発にも利用されています。

今回は、免疫組織化学実験の各ステップを順にご紹介していきます。

組織サンプルの調製

免疫組織化学実験では、良い特異抗体が入手できても組織サンプルの調製が適切に出来ていなければ、正確な解析ができなくなります。組織サンプルの調製では、細胞の形態やエピトープの抗原性を維持(あるいはエピトープを露出)することが重要です。

組織の固定化

固定液として広く利用されるのがホルムアルデヒドです。ホルムアルデヒドは、両末端がタンパク質などのアミノ基と結合するため、架橋剤の役割を果たし、組織構造が変化することや分解を受けることを避けて安定化させることができます。方法としては、組織切片を固定液に浸す浸漬固定法や心臓から血管に固定液を流す灌流固定法などがあります。固定液や固定化方法は解析する対象によって適当なものが異なるため充分な検討が必要です。より正確な解析を行う上で、固定化操作は最も重要なステップといえます。

組織包埋

組織の状態を長時間維持して観察に適した薄い標本を作製(セクショニング)するために、パラフィンをしみ込ませて固めるパラフィン包埋を行います。なお、架橋剤による固定化や有機溶媒(脱パラフィン処理で使用)が不適切なサンプルの場合、低温凍結用包埋剤に浸してから液体窒素で凍結させます。

切片化とマウント

厚みが5 mm以下の組織サンプルの場合、そのままガラススライドに貼り付けるホールマウント(whole mount)を行うこともありますが、同じ組織の免疫染色を複数行う場合には、ミクロトームを用いて4-5 µm程度に薄く切片化(セクショニング)します。作成した切片は、APTS (3-aminopropyltriethoxysilane)やポリリジンで処理したガラススライドや、ゼラチンやアルブミンなどを含む接着剤をコートしたスライドガラス上にマウントします。その後、組織切片をオーブンや電子レンジで乾燥します。

凍結組織の場合、クライオスタット(ミクロトームがセットされた低温装置)で切片化してガラススライドにマウントします。この切片は通常室温で一晩放置して乾燥させた後、-20℃のアセトンに浸して固定化します(乾燥ステップは組織や抗原に応じて省略することもあります)。

脱パラフィンと抗原賦活化

標的抗原に抗体がアクセスできるように、ホルマリン固定パラフィン包埋を行った組織切片から、パラフィンを除去(脱パラフィン)する必要があります。脱パラフィンには、キシレンや揮発性の有機溶剤を利用します。また、ホルムアルデヒド固定を行ったサンプルでは、メチレン架橋が生じるため、抗原エピトープのマスクや立体障害により、抗体のアクセスが阻害されることがあります。そのため、ホルマリン固定を行った組織切片は、抗体が抗原エピトープへアクセスしやすくなるように、熱処理や酵素消化といった抗原賦活化処理を行います。

非特異的結合のブロック

抗体は特異性が高いとはいえ、抗原とは別のタンパク質などに弱く結合してしまうことがあり、これが標的抗原の検出におけるバックグラウンドとなってしまいます。そこで、抗体の非特異的結合によるバックグラウンドを低下させるために、抗体を反応させる前に、組織切片をブロッキング剤で処理します。免疫組織化学実験では、ブロッキング剤として、二次抗体ホストと同種の非免疫血清(正常血清)が一般的に利用されます。そのほか、ノンファットミルク、BSA、ゼラチンなどを含むブロッキングバッファーも利用されます。

サンプルの免疫染色

抗体反応

一般的には、標的抗原と特異的な一次抗体を反応させた後、一次抗体と結合する標識二次抗体を反応させます。抗体を反応させた後は、非特異的に弱く結合した抗体を除去するために、適当なバッファーを用いてリンスします。蛍光抗体法の場合、蛍光標識抗体を用います。酵素抗体法の場合、酵素標識抗体と適当な発色基質を用います。酵素は一般的にHRP(西洋わさびペルオキシダーゼ)かアルカリフォスファターゼを利用し、それぞれDAB(HRP用の基質)やNBT/BCIP(アルカリフォスファターゼ用の基質)を利用します。発色基質は酵素と反応すると不溶性の発色沈殿を生じます。

カウンター染色

抗体による検出との対比や細胞構造の可視化を行うためにカウンター染色を行います。カウンター染色は通常、抗体反応後に行います。

色素のタイプ 色素 ターゲット
発色 Hematoxylin 青~紫
発色 Nuclear fast red (Kernechtrot) 核酸
発色 Methyl green 核酸
蛍光 Hoechst stain 核酸
蛍光 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 核酸
蛍光 Propidium iodide 核酸
蛍光 Fluorophore-tagged phalloidin アクチンフィラメント (蛍光色素による)

サンプルの可視化

酵素抗体法の場合、光学顕微鏡で観察します。蛍光抗体法の場合、蛍光顕微鏡で観察します。よりコントラストや分解能の高い画像を得るためには、共焦点顕微鏡を利用します。また、弊社細胞イメージ解析システムを用いることにより、特定のタンパク質や単一の細胞にとどまらず、複数の細胞の一つ一つについて自動的にデータ取得し統計学的に客観的な解析を行うハイコンテントアナリシスことも出来ます。
次回は、免疫組織化学において重要なステップである固定化について掘り下げてご紹介します!

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