検量線をひかずに定量する比較Ct法の予備実験|今こそ本気で徹底理解! リアルタイムPCR講座 第15回

検量線をひかずに定量する比較Ct法の予備実験|今こそ本気で徹底理解! リアルタイムPCR講座 第15回

比較Ct法の実践編、今回は予備実験でおこなう、PCR増幅効率の確認がテーマです。

比較Ct法では、ターゲット遺伝子と内在性コントロール遺伝子のPCR効率がほぼ等しいという条件が必須であることは、第13回,第14回で解説しました。つまり、先ずやるべきは、自分がつかうプライマーの増幅効率の確認です。ユーザーブリテン#2という小冊子(英文)に解析方法が記載されているので、みてみましょう(図)。

qpcr-basic15-fig

図 PCR効率の予備検討(ユーザブリテン#2, 14ページより抜粋)

  1. テンプレートの希釈系列を作成
  2. ターゲット遺伝子(例えばc-myc)と内在性コントロール遺伝子(例えばGAPDH)のCt値をリアルタイムPCRシステムで測定し、⊿Ct値を算出する
  3. 横軸の濃度のLog、縦軸⊿Ctをプロットし(下図)、近似式を求める
  4. 傾きが0.1より小さいとき(図例は0.0492)場合、2つの遺伝子のPCR効率はほぼ等しいと考える

ここでもし、PCR効率の等しいプライマーが得られない場合は、プライマーを再設計するか、増幅効率を反映して定量できる検量線法を採用する必要があります。

TS白神
ちょっと脱線しますが、イリノイ大学のBen-Shaharらは、比較Ct法を使用してforaging(for)遺伝子の発現量の変化がミツバチの自然な行動に影響を及ぼすことを報告しています(2002年、Science 誌)。for遺伝子は、多くのシグナル伝達経路で重要な役割を担うグアノシン 3′,5′-一リン酸依存性プロテインキナーゼをコードしています。ミツバチがある年齢に達し、for遺伝子の発現量が増加することで、巣内作業から採蜜作業へ行動を変化するという内容です。Ben-Shaharらは、様々な条件下における遺伝子の発現量の変化を比較Ct法で調べています(1)。前述のユーザーブリテン#2も、この論文のReferencesに記載されています。機会がありましたら、ぜひご覧下さい。

次回は、比較Ct法の実践編の最終回。どうしたら便利な比較Ct法をつかえるのか、さらに掘り下げてみていきます。お楽しみに!

参考文献

(1) Influence of gene action across different time scales on behavior. Ben-Shahar Y, Robichon A, Sokolowski MB, Robinson GE. Science. 2002 Apr 26;296(5568):636.

リアルタイムPCRハンドブック 無料ダウンロード

このハンドブックでは、リアルタイムPCRの理論や実験デザインの設計など、リアルタイムPCRの基礎知識が掲載されています。リアルタイムPCRを始めたばかりの方やこれから実験を考えている方にうってつけのハンドブックです。PDFファイルのダウンロードをご希望の方は、下記ボタンよりお申し込みください。
ダウンロードする

この記事に関する、ご意見・ご質問がございましたら、下記フォームからご連絡ください。

お名前 (必須)

メールアドレス (必須)

勤務先・所属先

題名

メッセージ本文

 確認ページはございません。内容をご確認の上チェックを入れてください

トレーニング