Ask TaqMan – リアルタイムPCRについての質問はありますか?

Ask TaqMan – リアルタイムPCRについての質問はありますか?

リアルタイムPCRを使い始めの方も、長年使っている方も、リアルタイムPCRやデジタルPCRについて質問があるでしょう。

そんなあなたの質問をAsk TaqManビデオで我々スタッフが答えます。皆様も疑問に思うことがあれば、Asq Taqmanで質問を投稿してみてはいかがでしょうか?

本日は、当ビデオシリーズから人気の高かったビデオを3つピックアップしました。

 

 リアルタイムPCRのスレッシュホールドってどこに引くの?

 

<ビデオの内容>

Q:

閾値とは何ですか?どこに設定すればいいですか?

A:

素晴らしい質問ですね。閾値とは、増幅曲線中の水平方向の直線です。閾値はy軸に沿って上下させることができます。閾値設定の目的は、データ取得部分をソフトウェアに指定することです。しかし、y軸上のすべての場所は同じではありません。避けたい領域がいくつかあります。具体的には、低過ぎると、ノイズ領域に入ってしまいます。

反対に、高過ぎると、データの予測が困難な増幅の直線相かプラトー相に入ってしまいます。

では、最適な場所とは?それはすべての曲線が真っすぐで互いに平行な場所です。最も重要なのは、反復精度が最大になるような場所に閾値を設定することです。一般的には、指数関数的増幅領域の中央付近またはそれよりやや高い所となります。いずれにせよ、高性能なアッセイでは適切な閾値設定は極めて容易です。全てのApplied BiosystemsリアルタイムPCRソフトウェアの初期設定は自動となっているので、”Analyze”をクリックした瞬間にソフトウェアが閾値を設定してくれます。

各アッセイに関して個別の閾値が設定されますが、これは全てのアッセイの最適な場所が同一ではないからです。

しかし、必要に応じて閾値のいくつかまたはすべてをマニュアルモードに切り替えることもできます。マウス操作でラインを上下に動かします。閾値が設定され、”Analyize”をクリックすると、全てのサンプルに関して各々のCt値が得られます。もし、閾値を上下させることができるのならば、Ct値が変わってしまうのでは?という疑問が浮かびます。全くその通りです。

しかし、閾値をしっかりと指数関数的増幅領域内に維持している限り、二つのサンプル間の相対的CtあるいはΔCtは一定のままです。このため、サンプル間での遺伝子発現の倍率変化を計算でき、標準曲線から定量情報を得ることができます。

 

 

リアルタイムPCRベースラインって何?

 

<ビデオの内容>

Q:

ベースラインって何ですか?気にする必要がありますか?

A:

ベースラインはとても重要です。ここに極めて標準的なリアルタイムPCR増幅曲線が並んでいます。各曲線には見慣れたベースライン、直線相、プラトー相があります。ここまでは問題ありません。しかし、初期サイクルにノイズがあります。ノイズは実際のシグナルが現れる前に見られます。増幅は十分に高くなってノイズを超えていきます。

ノイズは無用なものです。だから無視してもいいもいいはずですよね?ところが、違うのです。というのも…

このノイズが増幅曲線に影響を与えるのです。その影響を最小限に抑えるために効果的にノイズを差し引かなくてはなりません。そのために設定するのが、いわゆるベースライン設定です。それはノイズだけが観察されるサイクル領域であり、増幅曲線が現れる前の領域です。このベースラインが設定されると、ソフトウェアにより各ウェルからノイズが差し引かれデータ品質が大きく向上します。

一度y軸をリニアスケールに変えてベースライン操作の効果を見てみましょう。

ベースライン操作を行う前のデータでは、各サンプルの出発点がすべてy軸上でわずかに異なるため、リニアスケールでのこの曲線部分の見栄えがよくありません。しかし、ノイズを差し引くと、すべてのサンプルがゼロ点から出発し、その結果綺麗なデータが得られます。

バックグラウンドに関して規準化した後の値をΔRnと呼びます。対数スケールの増幅曲線をよく見ると、見慣れた増幅曲線のy軸上にプロットされているのがΔRnであることに気づきます。

Applied BiosystemsリアルタイムPCRソフトウェアにはベースライン設定のための方法が2種類あります。マニュアルモードとオートモードです。マニュアルモードで行う場合ベースライン領域の設定は、Analysis settingsをクリックして行います。1つのアッセイに設定した場合には、そのアッセイの全てのウェルに関して同じベースライン操作が行われます。Advanced settingsをクリックして各ウェルに別々の操作を行うことも可能です。

さらに便利なデフォルトでAuto baseline設定を使用することもできます。この場合、ソフトウェアが差し引くべきノイズを各ウェルに関して個別に決定します。これによって生成されるのが、一般的には最良の結果です。

では、なぜマニュアルモードが必要なのでしょう?実は、オートモードでは上手くいかない場合があるのです。特にSYBRアッセイや標準的でない実験系の場合です。オートモードで良好な結果が得られないケースは、増幅曲線の形を見れば分かります。もし増幅曲線が通常よりもS字型になっている場合、原因として、オートモードによりベースラインが正しく設定されておらず、エンドサイクルが低くなっている可能性があります。その結果、十分なノイズが差し引かれず、増幅曲線の形が異常になります。問題を解決するためには、マニュアルモードに切り替えてサイクル数を上昇させ、増幅曲線を正常な形にします。

 

リアルタイムPCRアッセイデザインのヒント

 

<ビデオの内容>

Q:

これまでPCRを行ってきた方が初めてリアルタイムPCRを行うとき何か特別なことをする必要があるのでしょうか?

A:

注意するべき1番目のポイントは、PCR産物の長さです。PCR産物鎖長が長すぎるとPCR効率が悪くなるため、可能なかぎり、PCR産物鎖長は150-150bpの範囲内で設計します。

2番目のポイントはミスマッチや既知のSNPを避けることです。増幅のタイミングが遅れます。定量実験では特に重要です。このため配列の正確性がとても大切です。

3番目のポイントは、配列の特異性です。特に非常に相同性が高い配列があると、非特異的な増幅の危険性が高まるので、少なくとも1本のオリゴには特異性の高い領域を含めて設計します。

最後のポイントは、繰り返し配列などの、配列の特異性が低くなる領域を避けることです。これらの条件をすべて満たすために、ご自身で配列情報を精査した後、Primer Expressソフトウェアで設計することができます。あとはオリゴ合成するだけです。

Primer Expressソフトウェアで設計すると、共通の条件で実験することができ最適化は不要です。またサーモフィッシャーサイエンティフィックでは、デザイン済み、およびカスタムデザインに対応した、高品質のTaqManアッセイをご提供しています。精査済みの配列、共通の実験条件、100%の増幅効率 これら全てがお客様に高いご満足をお届けします。また、様々な生物種に対応する遺伝子発現用の設計済み TaqManアッセイや、SNPタイピング、microRNAやコピー数多型検出用のアッセイもご提供しています。もし無くてもご安心ください、あなたのためのアッセイをご用意します。

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