【リアルタイムPCRユーザー必見】プライマーダイマーを減らす新しいSYBR Greenマスターミックスとは?

【リアルタイムPCRユーザー必見】プライマーダイマーを減らす新しいSYBR Greenマスターミックスとは?

リアルタイムPCRの解離曲線でみられる問題点

みなさんは、リアルタイムPCR (qPCR )の解離曲線(融解曲線)において、複数のピークを目にしたことがあるでしょうか? 下図は、一般的なSYBR Greenマスターミックスによって得られた解離曲線データです。

ご覧のとおり、ターゲットの86.7℃のメインピークのほかに複数のピークが確認できます。

 

しかし、ここで結果として見えてほしいのは、DNA由来増幅産物から得られる“ひとつの明確なピーク”です。なぜなら、qPCRの解離曲線において複数のピークが観察されるということは、2つ以上の目的以外のPCR産物が増幅されたことを示唆するからです。

※詳細については、3分で分かる動画も公開していますので、ぜひご覧ください。

では、そもそもなぜ目的以外の増幅が生じてしまったのでしょうか?

考えられる主な要因として、以下の2点が挙げられます。

  1. プライマーの非特異的な結合
  2. プライマーダイマー等の形成

対処方法には、温度条件変更やプライマーの再設計などいくつか対処方法がありますが、反応系の最適化に多くの時間や手間を要します。そこで今回は目的外の増幅を抑えることができる、新型のSYBRベースマスターミックス、Applied Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green Master Mixについて紹介します。

 

新しく登場したPowerUp™ SYBR™ Green Master Mixの特徴とは?

下図はPowerUp™ SYBR™ Green Master Mixと他社製品について、非特異的な増幅であるプライマーダイマー等の形成に着目し、性能を比較した結果です。テンプレートDNAを含まない状態でqPCRを行ったところ、他社製品(他社ミックスT1&T2)では高確率でプライマーダイマー由来と考えられる増幅が生じていますが、PowerUp™ SYBR™ Green Master Mixではほとんど目的以外の産物が検出されませんでした。

このことから、PowerUpTM SYBRTM Green Master Mixはプライマーダイマー等由来の非特異的増幅を防ぐのに適したマスターミックスだといえるでしょう。他にも、特徴的な機能がありますので、詳細はこちらをご覧ください。

  • 28種のプライマーセットを使用し、テンプレートDNAの代わりにNuclease Free Waterを添加し測定(n=3)
  • 増幅したウェルの陽性率およびCt値を算出し評価
  • Ct値が低いほど増幅が早く実際の定量値に影響を与えやすい

 

 

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